CRISPR

Overview

CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas9 기술은 미생물의 적응면역 현상에서 기인한 유전자 편집 기술로, target DNA를 정밀하게 잘라낸 다음 자연적으로 DNA가 복구되도록 함으로써 보다 간단하고 효율적으로 유전자 조작을 가능하게 합니다. 이 시스템은 gRNA (guide RNA)와 Cas9 nuclease로 구성되며, RNA 유전자 가위 (RNA-guided engineered nucleases, RGENs) 기술이라고도 불립니다.
gRNA는 target 서열에 상보적으로 결합하는 crRNA와 Cas9-binding을 위한 tracrRNA로 구성됩니다(Figure 1). gRNA는 Cas9을 target 부분으로 안내하는 역할을 하며, target DNA 서열과 상보적으로 결합합니다. Target DNA 서열 3’ 말단에는 PAM (Protospacer adjacent motif) 서열이 있어야 합니다.
gRNA가 Cas9 nuclease와 복합체를 형성하고 target 서열에 특이적으로 결합하면, Cas9 nuclease는 PAM 서열을 인식하고 PAM의 3 bp upstream 부분에 이중 가닥 손상(Double Strand Break, DSB)을 일으킵니다(Figure 2).

Figure 1. gRNA와 Cas9 nuclease gRNA는 target 특이적인 서열인 crRNA와, Cas9과 복합체를 이루는 scaffold 서열인 tracrRNA로 구성됩니다.	Figure 2. CRISPR-Cas9 system RNA-guided Cas9이 target 서열 3’ 말단에 있는 PAM 서열 (5’-NGG-3’)을 인식하고 3 bp upstream 부위에 DSB를 형성합니다.

DSB로 인해 손상된 DNA를 복구하기 위하여 세포는 일반적으로 두 가지의 경로를 거치게 됩니다: Non-homologous end-joining (NHEJ) 또는 Homology-directed repair (HDR) pathway.
Donor template이 없는 경우 NHEJ pathway를 통해 DSB가 재조립되며, 유전자 coding region 내에 Indel (Insertion and deletion) 생성으로 인한 frameshifts 및 premature stop codon으로 유전자 Knock-Out이 만들어집니다. 반면, HDR pathway는 Donor template에 의해 정밀하고 정확한 수정 및 새로운 유전자를 삽입할 수 있습니다(Figure 3).

Figure 3. CRISPR-Cas9-mediated DSB repair mechanisms DSB repair 메커니즘에는 NHEJ와 HDR pathway가 있습니다. NHEJ pathway는 DSB의 말단을 연결하는 과정에서 일부 염기가 삽입되거나 결실되어 Indel (Insertion and deletion) 변이를 만듭니다. HDR pathway는 Donor DNA (dsDNA Donor 또는 ssDNA Donor)의 homologous 서열을 통해 정확한 유전자 삽입이 가능합니다.

CRISPR-Cas9 실험 가이드

Knock-out

Knock-in

 STEP 1 
 유전자 편집은 target 유전자의 gRNA를 디자인하면서 시작됩니다. gRNA는 Cas9 nuclease를 Target DNA 서열로 유도합니다.

+ gRNA Validation을 통해 실험적으로 gRNA의 편집 효율을 확인합니다.

Knock-Out Service:

Transfected cell 서비스를 이용하시면 원하는 gRNA로 편집된 knock-out cell pool을 더욱 손쉽게 얻을 수 있습니다.

STEP 2 

RNA-guided Cas9 nuclease에 의해 절단된 DNA의 복구 방법 중 NHEJ pathway를 이용하기 위해서, 실험에 맞는 gRNA와 Cas9 nuclease의 형태를 결정하고 합성합니다.

    RNP (AccuTool™ aRGEN)
    Plasmid (AccuTool™ dRGEN)
    2-Part gRNA (AccuCRISPR™)

STEP 2 

절단된 DNA의 복구를 위한 또 다른 pathway인 HDR을 이용하기 위해서는 Donor DNA를 디자인합니다. 이후 Donor synthesis를 합니다.

합성된 Donor DNA와 함께 HDR pathway를 이용하기 위해서, 실험에 맞는 gRNA와 Cas9 nuclease의 형태를 결정하고 합성합니다.

    RNP (AccuTool™ aRGEN)
    Plasmid (AccuTool™ dRGEN)
    2-Part gRNA (AccuCRISPR™)

       

+

Knock-out 실험을 처음 진행한다면 실험에 필요한 모든 Materials와 Protocol이 담긴 All-In-One Kit인 AccuTool™ CRISPR-Cas9 Starter Kit를 추천합니다.

+

검증된 gRNA와 HDR Donor vector를 이용하여 human AAVS1 유전자 부위 또는 mouse ROSA26 유전자 부위에 원하는 유전자 삽입을 원한다면 AccuTool™ Safe Harbor Knock-In Kit를 추천합니다.

       

  STEP 3 

  gRNA, Cas9 nuclease와 함께 target 세포에 transfection 하여 정밀한 수정을 진행합니다.

+ Plasmid 형태의 Cas9과 sgRNA를 cell에 transfection 하고 싶다면 AccuFect™ Transfection Reagent를 추천합니다.

  STEP 4 

  유전자 편집 효율은 Mutation Detection Kit 또는 In/del analysis 서비스를 이용하여 Validation 합니다.