CRISPR

CRISPR Cas9기술은 살아있는 유기체의 DNA를 정밀하게 수정할 수 있게 해주는 혁신적인 유전자 편집 기술입니다. Target DNA를 정확하게 인식하고 결합하는 guide RNA와 target DNA를 절단하는 Cas9 nuclease로 구성되어 DNA 이중 가닥을 손상시키고 이것을 복구하는 과정을 통해 유전자를 조작할 수 있습니다.

gRNA는 target 서열에 상보적으로 결합하는 crRNA와 Cas9-binding을 위한 tracrRNA로 구성됩니다. gRNA는 Cas9을 target 부분으로 안내하는 역할을 하며, target DNA 서열과 상보적으로 결합합니다. Target DNA 서열 3’ 말단에는 PAM (Protospacer adjacent motif) 서열이 있어야 합니다.

gRNA가 Cas9 nuclease와 복합체를 형성하고 target 서열에 특이적으로 결합하면, Cas9 nuclease는 PAM 서열을 인식하고 PAM의 3 bp upstream 부분에 이중 가닥 손상(Double Strand Break, DSB)을 일으킵니다.

DSB로 인해 손상된 DNA를 복구하기 위하여 세포는 일반적으로 두 가지의 경로를 거치게 됩니다: Non-homologous end-joining (NHEJ) 또는 Homology-directed repair (HDR) pathway.

Donor template이 없는 경우 NHEJ pathway를 통해 DSB가 재조립되며, 유전자 coding region 내에 Indel (Insertion and deletion) 생성으로 인한 frameshifts 및 premature stop codon으로 유전자 Knock-Out이 만들어집니다. 반면, HDR pathway는 Donor template에 의해 정밀하고 정확한 수정 및 새로운 유전자를 삽입할 수 있습니다.

CRISPR-Cas9 기술은 1세대 ZFN (Zinc Finger Nuclease), 2세대 TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nuclease)보다 경제적이고 효율적인 강력한 3세대 Genome Editing Tool입니다.

1. gRNA 디자인: Knock out 및 knock in을 진행하려면 gRNA와 Donor 디자인이 필요합니다.
2. gRNA 합성: 디자인된 target sequence를 Plasmid 또는 ssRNA oligo 형태로 합성합니다.
3. cell에 도입 및 editing: 제작된 Cas9과 gRNA를 Target 세포에 transfection합니다.
4. Validation: Cell에서 gDNA prep 후 Mutation detection kit 또는 In/del analysis service를 통해 editing 효율을 확인합니다.
5. Analysis: 후속 실험을 진행합니다.

GC content는 40-80%, 길이는 18-20bp, sgRNA 서열 내 PAM 서열이 포함되지 않게 디자인하시는 것을 추천 드립니다. 사용하시고자 하는 Cas9의 PAM 서열을 원하시는 유전자에서 찾아 PAM site의 5’ upstream의 20nt로 디자인합니다.

sgRNA design이 어려우신 분들은 AccuTool ™ Custom Design Service 이용하시면 됩니다.

해당 서비스는 높은 on-target efficiency, 낮은 off-target effects의 서열 3-4개를 디자인하여 제공합니다. 높은 편집 효율을 위해 sgRNA는 최소 2개 이상 디자인하여 실험에 사용하는 것을 추천 드립니다.

Off-target effects는 Cas9이 표적 부위가 아닌 다른 위치에서 작용하여 의도하지 않은 DNA를 절단하는 것을 의미합니다.

Off-target을 줄이기 위해서는 sgRNA 디자인이 가장 중요합니다. Off-target effects는 in silico tool을 이용하여 예측할 수 있으며 sgRNA 서열을 기반으로 계산됩니다.

sgRNA(dRGEN)과 Cas9(pRGEN)을 1:1 비율로 transfection하여 사용하시면 됩니다.

형광이 tagging된 plasmid를 사용하신다면 일차적으로 transfection 효율과 screening이 가능합니다.

dRGNE 매뉴얼 링크

CMV promoter와 EF1a promoter는 Cas9 단백질을 발현하는 promoter로 사용됩니다.

CMV promoter는 다양한 포유류 세포에서 높은 수준의 Cas9 단백질 발현을 유도하는 강력한 promoter입니다. 따라서 높은 Cas9 발현 수준이 필요한 경우 CMV promoter의 사용을 권장합니다. 하지만 CMV promoter의 강한 발현으로 인해 의도하지 않은 위치에서 표적을 벗어난 편집이 일어나거나 세포 독성을 유발할 수 있습니다.

EF1a promoter는 여러 세포 유형에서 우수한 수준의 Cas9 발현을 제공하는 강력한 promoter입니다. CMV promoter와 달리 메틸화에 의한 유전자 silencing에 내성이 있기 때문에 안정적인 발현을 위해 적합한 promoter입니다. CMV promoter에 비해 표적을 벗어난 편집이 일어나거나 세포 독성을 유발할 가능성이 적습니다. 따라서 표적 외 효과 및 세포독성 최소화를 우선시하는 경우 EF1a promoter의 사용을 권장합니다.

promoter의 효과는 사용하는 특정 세포주에 따라 달라질 수 있습니다. 특정 세포주에 대한 권장 사항이 있는지 확인하려면 Cas9 플라스미드에 대한 문헌이나 기술 정보를 참조하여 선택하십시오.

sgRNA (single guide RNA)는 단일 RNA 분자로 custom-designed crRNA 서열과 scaffold tracrRNA 서열이 결합된 복합체를 말합니다.

2-part gRNA는 각각의 crRNA와 tracrRNA를 말합니다.

2-part gRNA를 실험에 적용하기 위해서는 crRNA와 tracrRNA를 hybridize하여 complex를 형성해야 합니다.

두 가지 모두 RNA oligonucleotide를 통해 합성이 되며 RNP 형태로 실험하기에 적합합니다. sgRNA (aRGEN)은 길이가 길기 때문에 2-part gRNA가 더욱 경제적이지만 sgRNA가 더욱 안정적입니다.

CRISPR-Cas9 유전자 편집을 위해 sgRNA와 cas9이 세포에 전달되는 형태로는 크게 두가지 RNP(ribonucleoprotein complex) 형태, Plasmid DNA 가 있습니다.

RNP (ribonucleoprotein complex)

구성: Cas9 protein + sgRNA (aRGEN)

전달: RNP complex -> transcription or translation 없이 직접 핵으로 전달 -> genome editing

• 장점:
  • 빠른 gene editing 가능: 전사 과정이 필요하지 않아 Plasmid DNA에 비해 빠르게 실험이 가능합니다.
  • 낮은 cytotoxicity: RNP는 protein과 sgRNA로 구성되어 있어 외부 DNA 전달이 필요하지 않으며 RNP는 빠르게 분해되어 낮은 cytotoxicity를 보입니다.
  • 낮은 Off-target effect: 세포 내 잔여 시간이 짧고 proteases와 RNases에 의해 분해되어 낮은 off-target을 보입니다.
  • in vitro, in vivo 모두 사용 가능

Plasmid DNA

구성: Cas9 plasmid + plasmid sgRNA (dRGEN)

전달: 핵으로 이동 -> sgRNA, Cas9 transcription -> Cas9 translation -> RNP 형성 -> 핵으로 이동 -> genome editing

• 장점:
  • 저렴한 비용: RNP에 비해 생산 및 조작 비용이 저렴합니다.
  • 긴 보관 수명: Plasmid DNA는 RNP보다 더 안정적이고 긴 보관 수명을 갖습니다.
  • 간편한 전달: 일반적인 형질전환 방법을 사용하기 때문에 간편하게 실험이 가능합니다.
  • Screening 용이: selection marker 발현 가능하여 형질전환 후 세포내에 전달이 되었는지 확인할 수 있습니다.

• 단점:
  • 느리고 효율성이 낮음: Cas9 발현 및 sgRNA 처리에는 시간이 걸리므로 RNP에 비해 편집 프로세스가 느리고 잠재적으로 효율성이 떨어집니다.
  • 높은 Off-target effect: RNP에 비해 Cas9과 sgRNA가 세포내에 긴 기간 남아 있어 off-target 가능성이 높습니다.
  • 높은 cytotoxicity: 외부 DNA가 전달되어 높은 cytotoxicity를 보입니다.

sgRNA의 평균 molecular weight는 32,212g/mol입니다.

ng으로 사용하시고자 하신다면 sheet에 기재된 분자량으로 하기 식으로 계산하시면 됩니다.

분자량 M.W. (g) X mole 수 (nmole) = sgRNA의 양 (ng)

Homology arm의 길이는 insert의 길이에 따라 달라집니다.

Point mutation과 같은 짧은 size insert의 경우 homology arm의 길이는 40nt-50nt를 추천 드립니다.

큰 size insert의 경우 homology arm의 길이는 300-800nt를 추천 드립니다.

• Mutation detection Kit (T7E1): T7 Endonuclease I (T7E1) 효소를 사용하여 빠르고 편리하게 KO 효율을 확인 가능한 Kit입니다. T7E1 효소는 mismatch를 식별하여 절단합니다. 해당 kit를 통해 단순하게 정량이 가능하지만 단일 뉴클레오티드의 정확한 분석은 불가능합니다.
  Mutation Detection Kit 매뉴얼 링크
• In/del analysis service: AccuCRISPR™ In/del analysis 서비스는 NGS를 통해 유전체의 특정 부분을 분석하는 Targeted resequencing 방법을 이용합니다. 표적 sequencing 방법으로 CRISPR-Cas9을 통한 유전자 편집 효율을 빠르고 정확하게 정량화 가능합니다.

Crispr 효율은 다음과 같은 요인에 따라 결정됩니다:

• sgRNA: 서열에 따라 효율이 달라지기에 sgRNA 서열 디자인이 중요합니다. 또한 2-3개의 sgRNA를 사용하시는 것을 추천 드립니다.
• Delivery Method: Host cell 또는 organism에 맞는 전달 방법을 사용합니다.
  전달 방법: Transfection reagent, viral-transduction, electroporation, Microinjection
• Crispr component format: sgRNA와 Cas9이 cell로 전달되는 형태는 DNA, RNA 그리고 RNP(pre-formed ribonucleoprotein complex)가 있습니다. 각각의 형태에 따라 적절한 전달 방법을 선택하여야 합니다.
  • DNA: 핵으로 이동 -> sgRNA, cas9 transcription -> cas9 translation -> RNP 형성 -> 핵으로 이동 -> genome editing
  • RNA: Cas9 mRNA가 cytoplasm 안에서 translated -> Cas9 protein 형성 후 gRNA와 RNP complex 형성 -> 핵으로 이동 -> genome editing
  • RNP: RNP complex -> transcription 또는 translation 없이 직접 핵으로 전달 -> genome editing
• Cas9 variant 사용: 바이오니아에서는 SpCas9의 variant인 Sniper Cas9을 판매하고 있습니다. Sniper Cas9은 Spcas9 WT보다 낮은 off-target effect와 높은 specificity의 특징을 가지고 있습니다. Lee, J.K., Jeong, E., Lee, J. et al. Directed evolution of CRISPR-Cas9 to increase its specificity. Nat Commun 9, 3048 (2018).