AccuRapid™ Midi Protein Expression kit (5 reactions)

현재까지 10 kDa - 150 kDa 분자량 범위의 단백질을 합성한 결과를 가지고 있습니다. 10 kDa 이하 또는 150 kDa 이상의 것도 합성이 될 수 있지만 보증하지 않습니다.
▶ AccuRapid™ Protein Synthesis Kit (Cat. No. K-7280, bioneer) 를 이용한 단백질 합성

Figure 1. SDS-PAGE data of various proteins synthesized from various templates
M: AccuRapid ™ Protein Size Marker (Broad) (Cat. No. D-2010, Bioneer)
1: CalmL3 (17.5 kDa)
2: DUSP3 (22 kDa)
3: CAT (24 kDa)
4: AcGFP (29 kDa)
5: ERFP (31 kDa)
6: EF-Ts (34 kDa)
7: VF (45 kDa)
8: BM3 (117 kDa)

합성 Kit에 따라 합성된 단백질을 획득하는 시간은 다릅니다. ExiProgen™ EC Protein synthesis Kit의 경우에는 6시간 이내에 합성된 단백질을 얻을 수 있습니다. 그 외 Kit에 대한 정보는 아래 표를 참고하시기 바랍니다. 또한, ExiProgen™ 으로부터 단백질 합성 후 최종 정제된 목적 단백질은 냉각 블록에서 저온상태 (4 - 8°C)로 유지됩니다. ExiProgen™을 Overnight으로 가동시킬 경우에도 별도의 냉장장치 없이 단백질을 안정하게 보관 가능합니다.

* 소량의 단백질 합성만을 원하시는 경우, 조절이 용이한 Manual Kit를 사용하시기 바랍니다.

Template DNA는 공통적으로 아래 그림과 같이 T7 promoter, RBS, His-tag과 T7 terminator의 구조를 가지고 있어야 합니다. His-tag을 붙이는 위치에 따라 2 종류로 제작을 하여 발현과 folding, 분리정제가 잘 되는 것을 선택할 수 있습니다. 이때에 template 형태는 plasmid DNA와 PCR product 두가지 중 선택할 수 있습니다. PCR product로 준비할 경우 빠르게 여러 종류의 template를 준비할 수 있는 장점이 있지만, 단백질 합성수율이 plasmid DNA에 비해 약간 떨어질 수도 있습니다. 특히 대량발현을 위해 장시간 반응시키는 SECF 방식을 사용할 경우 template의 안정성이 중요하므로 plasmid template를 권장합니다.

1) Plasmid DNA를 template로 사용할 경우, in vitro translation 전용 vector인 pBIVT vector (Cat. No. K-7350, Bioneer) 에 클로닝하여 사용하는 것을 추천 드립니다. 그 외에도 T7 system과 RBS, 정제 목적의 His-tag을 갖춘 발현 vector도 사용할 수 있습니다. 클로닝된 plasmid DNA는 AccuPrep® Nano-Plus Plasmid Mini Extraction Kit (Cat. No. K-3112, Bioneer)를 사용하면 10분 내에 고순도, 고농도의 plasmid DNA가 추출이 되어 편리하게 준비할 수 있습니다.

2) PCR product를 template로 사용할 경우, ExiProgen™ ProXpress PCR Template Kit (Cat. No. K-7400, Bioneer)를 사용하면 목적 유전자를 PCR로 증폭하여 클로닝 과정 없이 많은 수의 template를 손쉽게 준비할 수 있습니다. 준비된 template DNA의 순도는 A260/280 ratio가 1.8 - 2.0 범위에 있는 것을 사용해야 좋은 결과를 얻을 수 있습니다. 

Plasmid	Plasmid template generation by cloning
	1) pBIVT Vector (Cat. No. K-7350)
	2) pBT-7 vector (Gene synthesis service)
	3) Other vector may also be used. (ex. pIVEX, pK7, pET vector series)
PCR product	Linear template generation by PCR
	1) ExiProgen™ ProXpress PCR Template kit (Cat. No. K-7400)
	2) ExiProgen™ Protein Expression Optimization Kit (Cat. No. K-7410)

단백질 합성에 사용되는 template DNA의 양은 단백질 합성수율에 영향을 미치므로 적정량을 사용하여야 합니다. 사용되는 template DNA는 copy 수가 중요하므로 DNA 크기에 비례하여 정량적으로 넣어 주어야 합니다. 일반적으로 750 µl의 발현용액에 첨가되는 plasmid DNA의 양은 1 µg/kb, linear DNA의 양은 500 ng (≤1 kb), 1 µg (>1 kb)입니다. 자세한 내용은 Question 2)의 답변을 참고하십시오.

최적의 단백질 합성을 원하시는 경우 template DNA 사용량에 따라 단백질 발현양을 스크리닝하는 실험을 추천드립니다.

예시) AccuRapid™ Cell-Free Protein Expression Kit (Cat. No. K-7250)를 사용한 template DNA 사용량 최적화 실험

1. AccuRapid™ Cell-Free Protein Expression Kit를 준비합니다.

• 발현 볼륨: 45 µl

2. Template DNA를 다음과 같이 준비합니다 (1 kb의 plasmid DNA를 기준으로 함).

• DNA 기준 사용량: 60 ng
• DNA 테스트 사용량: 120, 240, 360, 480, 600 ng

3. AccuRapid™ Cell-Free Protein Expression Kit의 매뉴얼을 참조하여 반응을 진행합니다.

4. SDS-PAGE 분석을 통해 최적의 DNA 양을 확인합니다.

5. 최적의 DNA 사용량을 사용하고자 하는 단백질 합성 키트의 발현 볼륨에 맞게 환산하여 사용합니다.

• DNA 최적 사용량 (ng) * 사용하고자 하는 단백질 합성 키트의 발현 볼륨 (µl) / 45 (µl)

단백질 합성 키트는 E. coli 기반 발현 시스템이기 때문에 E. coli codon으로 최적화된 DNA의 경우 단백질의 합성량과 성공률이 높아질 수 있습니다.

ExiProgen^TM에서 사용하고 있는 정제방법은 바이오니아의 자체 특허기술로 만들어진 평균 직경 400 nm의 자성체 나노비드를 이용합니다. 자성체 나노비드 표면에 Ni-NTA가 고정화되어 있어서 목적 단백질의 His-tag에 강하게 결합하는 affinity purification 방법으로부터 단백질을 정제하게 됩니다. 이러한 정제과정은 ExiProgen^TM 안에서 전자동으로 이루어집니다.

단백질의 3차 구조로 인해 N-말단이나, C-말단에 위치한 His-tag이 외부로 노출되지 않아 단백질의 정상적인 folding을 방해하거나 일부만 노출될 경우에 Ni-NTA는 His-tag을 인지하지 못하여 정제 효율이 낮을 수 있습니다. 그러므로 단백질 합성을 위한 template을 설계할 때 단백질구조를 확인하여 단백질의 표면으로 노출된 말단에 His-tag을 부착하여야 합니다. 단백질 구조가 알려지지 않은 경우에는, His-tag의 위치를 N-말단과 C-말단에 위치한 것을 동시에 준비하여 발현과 정제가 잘 되는 것을 찾아야 합니다. 양쪽 말단에서 모두 발현정제가 안되는 경우 His-tag의 histidine의 개수를 늘려주는 방법으로 발현 및 정제 효율을 개선할 수 있습니다.

이런 방법으로도 발현정제가 안되는 경우에는 N-말단에 발현을 도와주는 단백질을 붙여서 soluble fusion 단백질을 만들어서 발현, 정제할 수 있습니다. 바이오니아에서는 효율이 좋은 발현 시스템을 지속적으로 개발하고 있으니 발현이 실패할 경우 회사로 문의해주시기 바랍니다.

대부분의 경우에는 단백질의 발현이 잘 되지 않아서 발생하는 문제입니다. Manual 키트인 AccuRapid™ 키트를 사용하여 적은 스케일로 template 최적화 과정을 통해 최적의 발현조건을 찾아서 ExiProgen™에서 같은 조건으로 running 시키면 단백질을 많이 얻을 수 있습니다. 그리고, 발현량은 많으나 정제효율이 낮을 경우 Question 7) 과 같이 His-tag의 위치 변화를 통해 정제 효율을 증가시킬 수도 있습니다.

각각의 ExiProgen^TM 단백질 합성 키트들은 2개의 박스, Kit ①과 Kit ②로 구성되어 있습니다.

Purification Kit (Kit ①)는 4℃ - 8℃, Expression Kit (Kit ②)는 -20℃ - -70℃에 각각 보관합니다. 장기보존시 Expression Kit (Kit ②) 내의 E. coli extract는 -70℃ 보관을 권장합니다. 제품 박스와 매뉴얼에 표기되어 있으니 참조하시기 바랍니다.

Cartridge는 4분할 사용까지 성능을 보장하고 있습니다. 4분할 사용을 원할 경우 overnight 사용은 권장하지 않으며, ExiProgen™ 구동 후 cartridge는 바로 권장온도에 보관해 주시기 바랍니다. Cartridge 커버를 덮은 상태로 cartridge ①은 4℃ - 8℃, cartridge ②는 -20℃ - -70℃에 보관하시기 바랍니다.

E. coli extract는 냉동과 해동을 반복할 경우, 성능이 저하됩니다. 튜브에 1회분으로 포장되어 있으니, Kit 구성품을 확인하시고 실험 계획에 맞게 사용하시기 바랍니다.