Gene to Protein Synthesis Custom Order

무세포 시스템에서 유전자로부터 단백질 합성하는 것은 살아있는 세포를 사용하는 것에 비해 독특한 접근 방식을 제공합니다. 과정은 다음과 같습니다.

1. 1. 무세포 추출물(Lysate)의 제조
• 첫 번째 단계에서는 세포 추출물을 생성합니다. 이것은 본질적으로 세포 용해물, 즉 열린 세포를 부수고 막과 세포 잔해를 제거하여 만들어진 현탁액입니다.
• 추출물은 리보솜, 운반 RNA(tRNA), 아미노산, 번역 과정에서 필요한 시작, 연장 및 종료에 관여하는효소를 포함하여 단백질 합성에 필요한 필수 요소를 보유합니다.
• 무세포 단백질 합성은 일반적으로 대장균(E. coli), 밀 배아(Wheat germ) 및 토끼 망상적혈구(Rabbit reticulocyte)의 용해물이 사용되며, 각각의 용해물은 사용자가 원하는 단백질에 따라 장점과 한계가 있습니다.
2. 2. DNA template 확보
• 필요로 하는 단백질을 암호화하는 DNA template가 필요합니다. DNA template는 주로 두 가지가 사용됩니다.
• Plasmid : 원형의 DNA로, 무세포 시스템에서 효율적인 전사를 위한 조절 요소를 갖도록 변형할 수 있습니다. Plasmid는 대량의 단백질이 필요할 때 자주 사용됩니다.
• PCR product : 원하는 유전자 서열이 포함된 특정 DNA fragment만 PCR을 통해 증폭하여 무세포 단백질 합성에 사용할 수 있습니다. 이 접근법은 plasmid 구성보다 빠르지만 단백질 양이 더 적을 수 있습니다.
3. 3. In vitro transcription(IVT)
• DNA template에서 mRNA를 합성하는 과정이 포함됩니다. 여기서 정제된 RNA polymerase는 DNA template 및 rNTP(A, U, C, G)과 함께 무세포 추출물에 도입됩니다.
• RNA polymerase는 DNA의 프로모터 서열을 인식하고 이를 사용하여 유전자를 상보적인 mRNA로 전사합니다. 이 mRNA는 단백질 합성을 위한 유전 정보를 담고 있습니다.
4. 4. 무세포 번역
• 합성된 mRNA는 번역에 필요한 모든 요소를 포함하는 무세포 추출물을 통해 번역됩니다.
• 추출물의 리보솜은 mRNA의 시작 codon(AUG)을 인식하고 단백질 합성을 시작합니다. 특정 아미노산을 운반하는 tRNA는 mRNA codon과 상호 작용하고 리보솜은 mRNA 서열에 따라 아미노산을 함께 연결합니다.
• 이 과정은 mRNA의 정지 codon에 도달하면 종료되고 번역 종결인자(release factor)가 결합하여 리보솜에서 완성된 단백질을 방출합니다.

무세포 단백질 합성의 장점

• 속도 및 편이성: 무세포 시스템은 세포 배양을 활용한 기존 방법에 비해 더 빠르고 효율적인 접근 방식을 제공합니다.
• 확장성: 반응량과 성분을 조정하여 단백질 생산량을 쉽게 조정할 수 있습니다.
• 순도: 무세포 시스템에서 합성된 단백질은 일반적으로 세포 배양 과정에서 생성되는 오염 물질이 없습니다.

무세포 단백질 합성의 응용

• 신속한 단백질 생산: 이 기술은 단백질 기능 연구 또는 단백질 활성 스크리닝과 같은 연구 목적에 유용합니다.
• 막 단백질 생산: 무세포 시스템은 살아있는 세포에서 발현하기 어려운 막 단백질을 생산하는 데 합니다.
• 체외 진단: 무세포 단백질 합성은 항체 검출을 위한 특정 항원을 발현함으로써 진단 도구를 개발하는 데 사용될 수 있습니다.
• 생물제조: 다양한 응용 분야를 위한 복합 단백질의 생산 가능성을 제시합니다.

바이오니아의 ExiProgen™은 자동화된 단백질 합성 및 핵산 추출을 위해 특별히 설계된 시스템입니다. 이는 본질적으로 연구 환경 내에서 이러한 프로세스를 단순화하고 합리화하는 투인원(two-in-one) 도구입니다. 주요 기능은 다음과 같습니다.

• ExiProgen은 무세포 단백질 합성 방식을 활용합니다. 이는 살아있는 세포에 의존하지 않고 단백질 생산을 위한 필수 요소(리보솜, tRNA, 아미노산 등)를 포함하는 특별히 준비된 추출물에 의존한다는 것을 의미합니다.
• 시스템은 완전히 자동화되어 있습니다.
  • 필요한 시약과 키트 구성품을 추가합니다.
  • 관심 단백질을 인코딩하는 DNA template(plasmid 또는 PCR product)을 주입합니다.
  • ExiProgen은 DNA template에서 IVT를 통해 mRNA를 생성하고 이후 mRNA를 단백질로 번역하는 전체 프로세스를 처리합니다.

• 자동화: ExiProgen은 수동 단백질 합성 기술에 비해 시간을 절약하고 인적 오류를 최소화합니다.
• 효율성: 이 시스템은 효율적인 단백질 생산을 위해 설계되었습니다.
• 다양성: 연구 요구에 따라 다양한 단백질 생산에 사용될 수 있습니다.
• 속도: 기존 방법에 비해 상대적으로 짧은 시간 내에 단백질 합성을 완료할 수 있습니다.
• 확장성: 살아있는 세포에서 발현하기 어려운 단백질을 생산할 수 있습니다.

다음은 무세포 시스템에서 히스티딘 태그(His-tag)를 사용한 단백질 정제에 대한 분석입니다.

His 태그가 붙은 단백질을 이용한 무세포 단백질 합성:

• His-Tag가 있는 DNA 구조: 관심 있는 단백질을 암호화하는 DNA 구성으로 시작합니다. 이 DNA 서열은 종종 단백질의 N 말단(시작) 또는 C 말단(끝)에 히스티딘 잔기 문자열(His-tag)을 코딩하는 서열을 포함하도록 조작됩니다.
• 무세포 단백질 합성:
  • 번역에 필요한 기계와 함께 세포 추출물이 포함된 무세포 시스템을 사용하여 DNA template에서 단백질을 합성합니다.
  • 번역하는 동안 리보솜은 원하는 단백질 서열과 함께 His-tag를 통합하여 mRNA 서열을 번역합니다.

His-Tag를 이용한 단백질 정제:

• 고정화 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC):
  • 이는 His 태그가 붙은 단백질을 정제하는 가장 일반적인 기술입니다.
  • 니켈(Ni) 이온으로 코팅된 비드가 포함된 크로마토그래피 컬럼을 사용합니다.
• 바인딩 및 세척:
  • His 태그가 붙은 단백질을 함유한 무세포 반응 혼합물을 크로마토그래피 컬럼을 통과시킵니다.
  • His 태그가 붙은 단백질은 비드의 니켈 이온과 특이적으로 결합하는 반면, 혼합물의 다른 단백질은 컬럼을 통해 흘러 폐기물로 수집됩니다.
  • 그런 다음 비특이적으로 결합된 분자를 제거하기 위해 세척 단계를 수행합니다.
• Elution: 정제된 His 태그가 붙은 단백질을 Elution하기 위해 경쟁 분자(주로 이미다졸)가 더 높은 농도로 포함된 용액이 도입됩니다. 이미다졸은 니켈 이온과 결합하기 위해 His 태그와 경쟁하여 His 태그가 붙은 단백질이 비드에서 분리되어 정제된 단백질 분획으로 수집됩니다.

무세포 시스템에서 His-Tag 정제의 장점:

• 특이성: His-tag는 복잡한 무세포 추출물에서 관심 단백질을 분리하는 구체적이고 효율적인 방법을 제공합니다.
• 단일 단계 정제: IMAC는 상대적으로 간단하고 빠른 기술로 무세포 반응 혼합물에서 단일 단계 정제를 제공합니다.
• 호환성: 무세포 시스템은 일반적으로 His-tag 정제 방법과 호환됩니다.
• His-Tag 절단(선택 사항): 어떤 경우에는 정제 후 His-Tag를 제거해야 할 수도 있습니다. 이는 His-tag와 단백질 사이의 링커 서열을 절단하는 특정 효소를 사용하여 달성할 수 있습니다.
• 최적화: 사용된 특정 단백질 및 무세포 시스템에 따라 IMAC 조건(예: 용리를 위한 이미다졸 농도)의 일부 최적화가 필요할 수 있습니다.

발현하고자 하는 단백질의 gene을 합성한 후에 ExiProgen™으로 단백질을 발현시킨 후 정제하여 보내 드리는 서비스입니다.
발현하고자 하는 단백질을 coding하는 gene을 단백질 합성용 키트에 첨가하여 ExiProgen™ 장비에 장착하고 매뉴얼대로 가동하면, 손쉽게 정제된 단백질을 얻을 수 있습니다.

Standard Gene to Protein Service는 gene 합성 (300 bp~3000 bp) 후에 gene이 expression vector (pBT7-N-His or pBT7-C-His)에 cloning된 plasmid 형태로 단백질 합성용 키트에 첨가하여 protein 합성을 진행하는 서비스입니다.
Cloning-free Gene to Protein Service는 AccuGeneBlock 서비스 (300 bp~1000 bp) 후에 gene을 PCR product형태로 단백질 합성용 키트에 첨가하여 Protein 합성을 진행하는 서비스입니다.