1) Cloning이란?
DNA 클로닝은 특정 DNA Segment(일반적으로 유전자)의 복사본을 만들 수 있는 분자 생물학의 초석과도 같은 기술입니다.
DNA 클로닝 유형은 다음과 같습니다.
- 플라스미드 클로닝(Plasmid Cloning)
가장 일반적이고 다양한 방법입니다. 플라스미드는 숙주 세포 내부에서 쉽게 복제할 수 있는 박테리아에서 발견되는 작은 원형 DNA 조각입니다. 이는 표적 유전자의 운반체 역할을 하여 표적 유전자의 증폭을 가능하게 합니다.
- 코스미드 클로닝(Cosmid Cloning)
코스미드는 플라스미드에 비해 더 큰 DNA 단편을 클로닝하는 데 사용됩니다. 코스미드는 최대 45,000개 염기쌍의 DNA를 보유할 수 있어 플라스미드에 적합하지 않은 긴 서열의 유전자 복제에 유용합니다.
- BAC 클로닝 (Bacterial Artificial Chromosome Cloning) 클로닝
BAC 클로닝은 최대 수십만 개의 염기쌍을 보유하는 매우 큰 DNA Segment를 복제할 수 있게 하는 기술입니다. BAC 클로닝은 박테리아 염색체에서 유래된 조작된 BAC 벡터를 활용합니다.
DNA 클로닝 작업순서:
- 1. 추출: 제한 효소 등을 사용하여 샘플의 유전체에서 표적 DNA segment(관심 유전자)를 추출합니다.
- 2. 벡터 선택: 표적 DNA의 크기와 원하는 특징을 기반으로 플라스미드와 같은 적합한 벡터를 선택합니다.
- 3. DNA Fragment 삽입: 특정 서열을 인식하는 제한효소로 타겟 DNA와 벡터를 모두 절단합니다. 제한 효소를 사용하여 유전자를 절단하게 되면 Sticky Ends 생성됩니다. 발생된 Sticky Ends를 활용하여 표적 DNA를 열린 벡터에 Ligase 효소로 삽입합니다.
- 4. 형질전환: 재조합 벡터(표적 DNA를 포함하는 벡터)를 숙주 세포(주로 박테리아)에 넣어주어야 합니다. 벡터를 넣어주는 방법은 Electroporation이나 Heat Shock과 같은 다양한 기술이 있습니다.
- 5. 복제: 재조합 벡터가 숙주 세포 내부로 들어가면, 재조합 벡터는 세포 분열 중에 숙주의 DNA와 함께 복제됩니다. 이로 인해 표적 DNA 단편이 증폭되어 수 많은 복사본이 생성됩니다.
2) Cloning 가능한 최대 사이즈는 얼마인가요?
클로닝할 수 있는 DNA의 최대 사이즈가 확실히 정해진 건 없습니다. 다만, 사용하는 방법에 따라 실질적인 한계가 있습니다.
플라스미드를 사용한 표준 클로닝
DNA 클로닝은 보편적으로 플라스미드를 사용합니다. 플라스미드를 이용한 방식은 일반적으로 최대 10,000 bp의 외부 DNA를 보유할 수 있습니다. 이는 벡터를 사용하는 클로닝 방식의 실질적인 한계입니다.
더 큰 DNA 복제 전략
- (1) 조각화 및 조립(Fragmentation and Assembly)
큰 유전자의 경우 이를 더 작고 관리하기 쉬운 조각으로 분해할 수 있습니다(Subcloning). 이렇게 만든 단편을 표준 플라스미드에 개별적으로 복제합니다. 나중에 Gibson 조립이나 Golden Gate 조립과 같은 기술을 사용하여 전체 길이의 시퀀스를 만듭니다. 이 접근 방식은 훨씬 더 큰 시퀀스를 효과적으로 복제할 수 있지만 더 많은 계획과 작업이 필요합니다.
- (2) 특수 벡터(Specialized Vector)
이례적으로 매우 큰 DNA 삽입물의 경우, 연구자들은 특별히 설계된 벡터인 BAC (Bacterial Artificial Chromosome)를 보편적으로 많이 사용합니다. BAC는 표준 플라스미드의 용량을 크게 초과하는 수십만 개의 염기쌍을 보유할 수 있습니다.
한계와 과제
- 기술적 어려움
실험실 수준에서 매우 큰 DNA 분자를 다루는 것은 점점 더 어려워지고 있습니다. 효소를 통한 Digestion 및 Ligation과 같은 기술은 단편이 클수록 효율성이 떨어집니다.
- 숙주 세포 안정성
큰 DNA 삽입물은 복제에 사용되는 숙주 세포(주로 박테리아)를 방해할 수 있습니다. 숙주 세포의 메커니즘은 큰 외부 DNA 조각을 복제하고 안정성을 유지하기 어려운 경우가 많습니다.
3) Cloning 방법은 어떤 것이 있나요?
모든 Cloning 방식의 원리는 dsDNA의 양끝 말단의 overhangs을 형성시켜 서로 연결하는 방식이며, overhangs 형성 방식에 따라 Cloning 방법이 분류됩니다. Cloning 방법은 크게 Ligation 방식과 sequence homology를 이용한 방식으로 나눌 수 있으며, 다른 방식도 존재합니다. 각 방법의 예시는 다음과 같습니다.
- Ligation 방식
Restriction Enzyme Cloning, TA Cloning (PCR cloning), Golden Gate assembly 등
- Sequence homology 방식
Gibson assembly, In-Fusion cloning 등
- 기타
In-vivo cloning(Yeast homologous recombination 이용), Overlapping PCR, Ligation Independent Cloning (LIC) 등
4) Cloning 하고자 하는 유전자를 보유하고 있지 않습니다. 서비스가 가능한가요?
Insert를 보유하고 있지 않은 경우, 유전자 합성 서비스를 통해 insert를 제작하고 cloning에 대한 서비스를 받으실 수 있습니다. 유전자 합성 서비스를 활용하시면 자사에서 제공해드리는 벡터를 무료로 사용하실 수 있습니다.
5) Cloning 서비스를 이용하고자 합니다. sample은 어떻게 제공해드리면 되나요?
서비스가 가능한 Sample의 조건은 다음과 같습니다.
- DNA 농도 : 100 ~ 200 ng/µl
- Sample 양 : 10 µl 이상
보내실 때에는 포장박스에 소속기관과 의뢰자명을 정확히 기입하시고, 아래 안내 드리는 지정 택배사를 통해 sample을 보내주시면 됩니다. 운송비는 template 개수에 상관없이 바이오니아에서 부담합니다.
(단, 지정 택배사 외에 다른 택배사를 이용하시면 운송비는 고객께서 부담하셔야 합니다.)
당사연계택배회사 (롯데택배 1588-2121)
