AccuPower® qPCR Array Service

논문 게재를 위한 qPCR 실험 지침서인 MIQE† (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) 가이드라인을 따르는 qPCR 분석 서비스입니다.

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카탈로그 번호
S-6001

개요

  • 바이오니아의 qPCR Array Service는 Real-Time PCR 전문가들의 지침이자, 논문 출판을 위한 qPCR 실험 지침서인 *MIQE 가이드라인을 준수한 qPCR 분석 서비스를 제공합니다.

    *MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) Guideline은 qPCR 전문가들이 “qPCR 유전자 발현분석” 논문들의 품질관리를 위해 합의한 논문임: Bustin, S.A., et al. 2009. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments, Clinical Chemistry 55:4, 611-622.

특장점

  • 핵산추출부터 qPCR 분석까지 가능한 올인원 서비스
  • 정확하고 신속한 고품질 qPCR 분석 서비스 제공
  • 고객 맞춤 qPCR 분석 서비스
  • Primer set up 시간 및 비용 절감
  • NGS 데이터 검증 – qPCR validation

서비스 목록

의뢰 샘플의 종류에 따라 당사의 고순도 고효율 RNA 추출 키트 중 적합한 RNA 추출 키트를 적용하여 Total RNA 추출이 진행됩니다. 또한, mRNA 정량분석에 영향을 주는 gDNA를 제거하기 위하여 RNase free DNase I을 처리합니다.

추출된 Total RNA에 포함되어 있는 불순물들은 PCR 중합효소반응을 저해하여 증폭 효율에 영향을 줄 수 있으므로 분광광도계를 이용하여 핵산의 정량 및 순도를 측정합니다. RNA가 많이 분해되면 정확한 발현량을 알 수가 없으므로 Capillary Gel 전기영동을 이용하여 RNA Quality Score (RQS)를 측정합니다. 측정된 결과는 리포트로 제공해 드리며, RNA의 순도 및 분해 정도가 권장값 (RQS>8.0)을 만족하는 경우에만 다음 과정으로 바로 진행됩니다.

*고객의 요청 시, RQS가 미달하는 샘플에 대해서도 qPCR 서비스 진행은 가능하나, 바이오니아는 해당 도출데이터의 신뢰성을 보증하지 않습니다.


Figure 1. Total RNA quality check 결과 예시. Agilent사 5200 Fragment Analyzer 결과.

Primer BLAST 및 bioinformatics tool을 이용하여 타겟 특이적인 primer를 디자인합니다. 타겟유전자의 모든 transcript variants를 증폭하도록 primer 디자인하며, self-dimer 형성 서열은 배제합니다. 디자인 및 합성된 primer는 Stratagene reference total RNA (Human, Mouse, Rat)와 같은 표준 template 또는 제공해주시는 template을 이용하여 표적 특이적 증폭 여부를 확인 후, qPCR 분석에 사용합니다.


Figure 2.  (A, B) Exicycler™ 96 Real-Time Quantitative Thermal Block을 이용하여 타겟유전자의 증폭 여부 및 단일 melting peak 확인. (C) PCR product를 전기영동하여 target specific 단일 band 확인.

cDNA 합성은 mRNA에 따라 합성효율 차이가 커서, RNA quality와 함께 유전자발현 분석에 큰 영향을 미치는 중요한 과정입니다. 바이오니아의 특허기술인 Thermostable RTase (RocketScript™ Reverse Transcriptase)와 순환 온도 역전사 반응 (CTRT, Cyclic Temperature Reverse Transcription) 기술을 이용하여 복잡한 2차 구조 (Secondary Structure)의 RNA를 효과적으로 full-length cDNA를 합성할 수 있어 정확한 발현분석이 가능합니다. 이때 사용되는 RT 프라이머는 고객의 연구 목적에 따라 Oligo dT, Random primer(dN6, dN12)를 이용합니다.


Figure 3. 바이오니아와 타사 cDNA 합성 효율 비교 결과.

바이오니아의 qPCR Array Service는 qPCR 실험의 숙련된 전문가에 의해 이루어집니다. 고감도 검출 광학계로 전 세계 주요국에 특허 등록된 Exicycler™ Real-Time Quantitative Thermal Cycler를 사용하여 높은 신뢰도의 qPCR 데이터를 산출하고 있습니다. 모든 장비를 ISO 규정에 의해 정기 점검, 관리하고 있습니다.


Figure 4.  Exicycler™ 96 Real-Time Quantitative Thermal Block과 Exicycler™ 384 Real-Time Quantitative Thermal Block 및 Amplification curve.

qPCR 결과 분석 및 제공

qPCR을 이용한 상대정량분석은 2-ΔΔCt 방법을 이용하여 진행합니다. qPCR 데이터는 엑셀파일로 제공되고, raw Ct 값, melting curve analysis data, p-value, fold change 등이 기본적으로 제공되며, 추가 요청에 따라 scatter plots, volcano plots, heat map image등이 분석결과에 포함됩니다. (Exicycler™ 분석 software가 설치된 경우 qPCR raw data제공). 또한, MIQE guideline에 따른 유전자 정보, amplicon 크기, PCR 조건 등 프라이머에 대한 정보도 제공됩니다.


Figure 5.  qPCR 분석 결과. (A) Fold change. (B) Heat map. (C) Scatter plot. (D) Volcano plot.

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